Medical practices evolved over millennia, from ancient civilizations like Egypt and Mesopotamia to the groundbreaking
摘要：慢病毒載體（LV）在基因治療領域展現出巨大潛力，但其大規模生產，尤其是下游純化環節，一直是走向臨床和商業化的主要瓶頸。本期分享的這篇來自*Molecular Therapy Methods & Clinical Development*的研究，由芬蘭庫奧皮奧基因與細胞治療中心的Anniina J. Valkama等人完成，系統性地開發并優化了一套可規模化的LV下游生產工藝，成功處理了180L的初始收獲液，最終獲得了高滴度、高純度的臨床級候選產品。本文將為您解讀該研究的核心內容與重要發現。
一、研究背景：為什么下游工藝如此重要？
慢病毒載體能夠感染分裂和非分裂細胞，已成為基因治療的熱門工具，用于治療癌癥和血液疾病，更多療法正處于臨床試驗階段。
然而，將實驗室規模的LV生產成功轉化為滿足臨床需求的大規模生產充滿挑戰。LV顆粒脆弱，容易在處理過程中失去活性。上游生產（病毒培養）的規模擴大已取得進展，但下游處理（DSP：澄清、濃縮、純化、制劑）則成為新的“卡脖子”環節。如何高效地從大量培養液中捕獲、純化并濃縮LV，同時保持其高感染活性并去除雜質（如宿主細胞DNA、蛋白質），是本研究致力解決的核心問題。
二、下游工藝全流程概覽
1.澄清（Clarification）：去除細胞碎片和大顆粒雜質。
2.濃縮與緩沖液交換（TFF1）：使用切向流過濾（TFF）技術濃縮病毒液，并將其置換到適合層析純化的緩沖液中。
3. 捕獲純化（Chromatography）：使用陰離子交換（AEX）層析作為核心純化步驟，有效去除宿主DNA和蛋白質等雜質。
4. 最終制劑（TFF2）：再次使用TFF將純化后的病毒置換到最終制劑緩沖液中，以確保長期儲存的穩定性。
流程核心：盡可能減少步驟、縮短處理時間，以最大限度保持LV活性。
三、關鍵步驟的深度優化與發現
1.澄清：平衡雜質去除與病毒回收率
●挑戰：需要高效去除雜質，同時避免病毒被吸附或機械損傷。
●發現：比較了不同孔徑和材料的深度過濾器。較大孔徑的過濾器雖然DNA清除率略低，但病毒功能活性回收率（75%-90%）顯著更高，因此被選為最佳方案。
●重要技巧：過濾后使用緩沖液沖洗過濾器，可額外增加高達60%的病毒回收量，這一操作在放大生產中被證明至關重要。
2.切向流過濾（TFF1）：選擇與優化
●挑戰：濃縮過程會產生剪切力、壓力變化和泡沫，可能導致病毒包膜破裂失活。
●膜材與截留分子量（MWCO）選擇：
⑴材料：纖維素膜親水性更好，跨膜壓力（TMP）增長更慢，更不易堵塞，更適合大規模生產。
⑵MWCO：300kd膜DNA清除率更高，但100kd膜的功能病毒回收率更優。
⑶參數優化：本研究TMP控制在0.2-0.5bar，確定了關鍵操作參數（如通量、跨膜流速百分比），以確保高回收率（約75%）。研究還發現，在過程結束時關閉滲透流進行循環沖洗，可顯著提高最終產物的回收量。
3.層析純化：突破瓶頸的關鍵
層析步驟是下游工藝中回收率損失最大的環節，也是優化的重點。
●介質篩選：結果表明，Q膜析介質從濃縮液（TFF1產物）中回收功能性病毒的效果最好且最穩定。
●洗脫策略：線性梯度洗脫通常出現兩個峰，第一個峰（在電導率開始上升時立即洗脫）含有最完整的病毒，雜質（DNA）較少；第二個峰含有大量DNA和少量病毒。優化后采用階梯梯度洗脫（12%, 30%, 45%緩沖液B），成功將主要病毒產品富集在12%洗脫峰中，提高了目標產物的純度。
●挑戰與取舍：高鹽濃度洗脫可以提高病毒回收率，但也會帶入更多雜質。因此，必須在回收率和純度之間找到平衡。該研究通過優化，實現了98%以上的宿主DNA清除率。
4.最終制劑：為病毒“保鮮”
LV的穩定性至關重要。研究團隊篩選了多種最終制劑緩沖液（FFB），以評估它們在-80℃、4℃和室溫下的保護效果。
核心發現：
●-80℃儲存：含10%蔗糖的50mM HEPES緩沖液和含20mM MgCl?的PBS緩沖液在保持病毒活性方面表現最佳，顯著優于普通PBS。
●4℃和室溫：所有緩沖液都無法完全阻止活性下降，但含5%蔗糖和20 mM MgCl?的HEPES緩沖液相對最好。
●最終選擇：結合上述發現，選擇50mM HEPES + 20mM MgCl?+ 10% sucrose （pH 7.5）作為最終制劑緩沖液，以兼顧長期冷凍儲存和短期操作穩定性。
四、規模化生產成果
研究團隊成功進行了兩次大規模生產運行（一次使用LV-GFP，一次使用LV-TK），驗證了工藝的可放大性。
第二次規模化運行（LV-TK）結果：
起始體積：178.4 kg（約180升）收獲液。
最終產品：570 mL。
最終滴度：功能滴度高達1.97×109TU/mL。
總產量：1.12×1012個轉導單位（TU）。
純度：宿主DNA清除率達到99.8%。
產品質量：病毒顆粒與功能顆粒的比值（vp/TU）約為3.5×103，與同類大型生產報告的質量相當。
安全性：最終產品經檢測，不含復制型慢病毒。
文獻信息：Valkama, A. J., et al. (2020). Development of Large-Scale Downstream Processing for Lentiviral Vectors. Mol. Ther. Methods Clin. Dev., 17, 717-730.DOI: 10.1016/j.omtm.2020.03.025